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王晓宁1,2,江成龙1,2,邓锴1,2,3,刁红录1,2,3,4,张昌军1,2,3
(1医院·湖北医院生殖医学中心;2湖北省生殖医学临床医学研究中心;3湖北医药学院生物医学工程学院;4湖北医药学院生物医药研究院)
摘要
目的：探讨不同促排卵方案在胚胎植入前遗传学诊断助孕中的效果。
方法：回顾性分析53个胚胎植入前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiagnosis，PGD)周期，比较长方案与高孕激素状态下促排卵(progestinprimedovarianstimulation，PPOS)方案间患者的促排卵天数、促性腺激素(gonadotropin，Gn)用量、促排卵期间性激素变化、获卵数、成熟卵数、2PN受精数、2PN受精率、优胚率、囊胚形成数、囊胚形成率、有可供活检囊胚周期率、可供活检囊胚数、活检后有可利用囊胚周期率、活检后有可利用囊胚率、复苏移植周期生化妊娠率、临床妊娠率、胚胎着床率、流产率、异位妊娠率的差异。
结果：(1)两组Gn用药天数、扳机日FSH、扳机日LH、扳机日P、成熟卵数、2PN受精率、优质胚胎率、囊胚形成数、囊胚形成率、可供活检囊胚数、活检后有可利用囊胚周期率、活检后有可利用囊胚率相比差异无统计学意义;(2)长方案组促排卵Gn用量、扳机日E2、获卵数、2PN受精数、有可供活检囊胚周期率显著高于PPOS组(P0.05);(3)两组患者临床妊娠率及胚胎着床率相比差异无统计学意义。
结论：长方案与PPOS方案均能为PGD助孕患者提供相似的临床妊娠率，PPOS方案经济、简单、方便的特点可作为PGD助孕患者的一种选择。
关键词:胚胎植入前遗传学诊断;降调节;高孕激素状态下超促排卵;妊娠
植入前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiagnosis，PGD)是在胚胎植入之前对其进行诊断，筛选正常胚胎进行移植。控制性促排卵是植入前遗传学诊断中的关键步骤之一，即通过使用外源性促性腺激素(gonadotropin，Gn)促进卵泡的生长，形成一定数量的成熟卵子，以提供数个与子宫内膜发育同步的优质胚胎进行移植，从而提高助孕结局。因此，对于接受PGD助孕治疗的患者，在进行促排卵前正确评估卵巢的储备功能及反应性有助于选择合理的、个性化的促排卵方案，调整用药剂量，改善临床结局，降低并发症的发生。本中心自年开展PGD助孕以来，比较了不同促排卵方案之间PGD患者的实验室参数指标以及胚胎移植后的临床妊娠率、胚胎着床率的差异，以拓展新的PGD助孕的促排卵临床方案。
资料与方法
1研究对象选择及分组
回顾性分析年1月-年1月间在本中心因染色体异常寻求辅助生殖治疗的PGD周期的资料。纳入标准:(1)月经周期规律;(2)年龄20~35岁;(3)2ng/mL≤抗苗勒管激素(anti-mullerianhormone，AMH)≤10ng/mL，既往无卵巢过度刺激综合征(ovarianhyperstimulationsyndrome，OHSS)及卵巢低反应史;(4)阴道超声提示7个≤双侧窦卵泡数≤15个;(5)无子宫及卵巢病变;(6)夫妇双方至少一人外周血染色体核型分析诊断染色体异常核型。其中女性染色体异常者24例，男性染色体异常者29例。
排除标准:(1)卵巢储备功能下降;(2)子宫内膜异位症;(3)多囊卵巢综合征;(4)双侧输卵管积水。
分组:共纳入53个周期，根据促排卵方案不同分为长方案组、PPOS方案组。其中长方案组33例，PPOS方案组20例。
2促排卵方法
长方案组:采用标准长方案促排卵，从上一月经周期的黄体中期(月经第21日)开始使用达必佳(德国辉凌)0.1mg/d长方案行垂体降调节20d后，加用促性腺激素(Gn，r-hFSH，瑞士雪兰诺，75IU/d)或/和hMG(丽珠集团丽宝生物化学制药有限公司)行超促排卵，促排卵期间B超监测卵泡的发育情况，当直径达18mm的卵泡＞2个时，停用r-hFSH和hMG，注射艾泽(r-hCG，瑞士雪兰诺)μg，36h后在B超引导下行穿刺取卵术。
PPOS方案组:采用年KuangY[1]等提出的PPOS方案，月经第2~4日开始使用安宫黄体酮片(MPA，2mg/片，浙江仙琚制药)10mg/d和尿促性素针(乐得宝)~IU/d至hCG扳机日。当有3个卵泡直径≥18mm时，给予人绒毛膜促性腺激素(hCG，IU/支，丽珠集团丽珠制药厂)IU及GnRHa(达必佳，0.1mg/支，FerringGmbH辉凌，德国)扳机，34~35h后行穿刺取卵术。
3取卵
患者取膀胱截石位，手术在阴道超声引导下进行。阴道B超(日本AlokaSSD-型超声诊断仪)，阴道探头频率7MHz。常规消毒，铺巾，局部麻醉镇痛后放入阴道探头及穿刺架，彻底扫描盆腔，了解子宫、卵巢的位置和可及度，并确定进针位置。用单腔取卵针(美国COOK公司)，抽吸的卵泡液递进胚胎实验室由技术人员在体式显微镜下寻找卵冠丘复合体。记录取卵时间，并对所回收卵母细胞质量及胚胎质量进行评分。
4受精与胚胎
取卵后行卵胞浆内单精子显微注射(intracyto-plasmicspermmicroinjection，ICSI)受精，受精后16~18h观察原核情况，若出现两原核判断为正常受精。受精后胚胎在体外培养24~48h，于取卵后的第3天根据ZiebeS等[2]移植胚胎进行胚胎形态学评分，Ⅰ~Ⅱ级为优质胚胎，Ⅰ~Ⅲ级胚胎均为可用胚胎，Ⅲ级以上进行囊胚培养。
5活检
当胚胎发育至第5天或第6天的囊胚时，取滋养外胚层细胞3~5个，放入PCR管内待用。
6胚胎冻存
对于取出活检细胞后的胚胎，先放置于液氮中保存，若PGD检测结果为整倍体胚胎，则可进行移植，若为非整倍体胚胎，经患者夫妇知情同意签字确认后废弃。
7PGD检测
采用iDOP-PCR技术进行全基因组扩增，参照BlagodatskikhKA等[3]改进的DOP-PCR技术，采用array-CGH技术检测胚胎整倍体情况。
8胚胎分类的定义
整倍体胚胎:经array-CGH检测后提示为整倍体的胚胎;异常胚胎:经array-CGH检测后信号异常的胚胎。
9胚胎复苏及胚胎移植
内膜准备采用激素替代周期:于月经第3天注射长效GnRHa3.75mg(达必佳，辉凌制药)，35d后开始口服戊酸雌二醇(拜耳医药，德国)4mg/d，月经第10天开始定期B超监测子宫内膜发育情况，同时根据内膜发育情况调整戊酸雌二醇剂量；当子宫内膜厚度≥7mm时，加用黄体酮注射液(浙江仙琚)80mg/d肌肉注射给药行内膜转化，5d后行囊胚解冻移植，移植后14d测血β-HCG确定生化妊娠，移植后30dB超可见妊娠囊确定为临床妊娠，临床妊娠后每月随访1次至分娩。
10激素检测
内分泌检测:控制性超促排卵周期中抽取静脉血，应用DXI全自动电化学发光免疫分析系统(美国贝克曼库尔特公司)进行内分泌(血清激素FSH、E2、P、LH)的测定。相应试剂盒购自武汉德高科技有限责任公司，操作按试剂盒说明书要求进行，控制试剂批内及批间差异10%以内。
11统计学方法
采用SPSS24.0软件包进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两样本间率的比较采用χ2检验，P0.05为差异有统计学意义。
结果
1一般情况比较
两组患者的平均年龄、不孕年限、BMI、AMH、基础窦卵泡数、基础性激素FSH、LH、E2、P均没有差异性(P0.05)(见表1)。
2促排卵情况比较
两组患者相比，Gn用药天数、HCG日直径＞14mm卵泡数、HCG日FSH、HCG日LH、HCG日P差异均无统计学意义(P0.05)。PPOS方案组Gn用药总量较长方案组显著减少(P0.05)，HCG日E2较长方案组明显降低(P0.05)(见表2)。
3实验室指标比较
两组患者取卵后实验室指标相比较，长方案组患者在获卵数、2PN受精数、有可供活检囊胚周期率上较PPOS组均显著升高(P0.05)，其他实验室指标，如成熟卵数、2PN受精率、优质胚胎率、囊胚形成数、囊胚形成率、活检后有可利用囊胚周期率、活检后有可利用囊胚率两组相比差异均无统计学意义(P0.05)(见表3)。
4胚胎复苏后移植妊娠结局情况比较
两组患者胚胎检测后行胚胎移植，移植日内膜厚度、平均移植胚胎个数、复苏后移植生化妊娠率、临床妊娠率、胚胎着床率均无统计学差异，流产率、异位妊娠率、分娩率因数目太少无法进行统计学分析(见表4)。
讨论
接受PGD助孕的患者要想得到理想的助孕结局，必须选择合理的促排卵方案，使多个卵泡同步发育成熟，获得足够多的高质量卵子。目前针对PGD助孕患者的最佳促排卵方案文献尚无报道。
有研究报道，黄体期短效GnRH-a长方案具有较好地抑制内源性LH峰、阻遏卵泡过早黄素化及卵子早熟，促进卵泡发育同步化等优点[4]，临床应用广泛、成熟。目前国内推荐卵巢正常反应人群首选GnRH-a降调节长方案，大多数患者可获得较满意的卵巢反应，获得优质胚胎[4]。对于PGD助孕患者，大部分生殖中心选择黄体期短效GnRH-a长方案，但是，GnRH-a降调节长方案患者部分可能出现GnRH-a降调节后垂体过度抑制，相应Gn时间、剂量增大，影响卵母细胞质量，进而导致胚胎质量下降，影响助孕结局[5]。该方案促排卵还存在患者费用高、治疗时间长、卵巢过度刺激综合征(OHSS)发生风险大的缺点。
为了克服GnRH-a降调节带来的卵巢过度抑制、Gn用量大、卵巢过度刺激综合征(OHSS)风险高等弊端，非垂体降调节方案的应用逐渐增多。KuangY等[6]发现在一定雌激素基础上，孕激素抗正反馈机制可以抑制内源LH峰，并将这种早卵泡期持续应用孕激素抑制内源性LH峰结合Gn促排卵的方案定义为PPOS方案[6]。其后在尝试卵巢储备功能正常[7]、多囊卵巢综合征(PCOS)高反应[8]、卵巢储备功能下降[9]患者的应用中，均取得了良好临床妊娠结局。有文献报道，PPOS方案中相对更高一些的LH水平或许更有利于患者获得优质胚胎[10]。
在本研究中，PPOS方案在促排卵过程中使用Gn总量上显著少于长方案，分析原因可能为：长期使用GnRH-a会使卵巢性腺轴的分泌受到抑制，且这种抑制作用呈时间和剂量的依赖性[11]，如垂体降调过度，则促排中促性激素的用量可能会增加。PPOS方案中高孕酮水平能够形成反馈，使垂体分泌LH受到抑制，从而有效抑制提早发生的LH峰，但不会过度抑制LH分泌，所以在减少促性激素用量上相对占有一定优势，该结果与张欣等[12]报道一致。同时，PPOS方案HCG日雌激素水平显著低于长方案组，这样从一定程度上也起到了降低卵巢过度刺激的风险。从两组患者助孕的实验室结局方面分析，PPOS方案组的获卵数、2PN受精率、有可供活检囊胚周期率均显著低于长方案组，与张欣等[12]研究显示的PPOS方案的获卵数少于长方案结果一致。从两组患者胚胎移植后妊娠结局分析，两组临床妊娠率、胚胎着床率等指标差异无统计学意义。总体来说，PPOS方案在减少Gn用量、节省治疗时间和预防OHSS发生上有一定的好处。大部分接受PGD助孕的患者在等待PGD遗传学检测结果时需要对活检后的胚胎进行冷冻保存[13]。故PPOS方案简单、方便、费用低，更适合经济拮据的普通人群，且已经有学者通过对其出生子代的随访也肯定了其临床安全性[14]。
综上所述，对正常反应人群来说，在接受PGD助孕患者中使用PPOS方案可以获得接近长方案的助孕效果，PPOS方案可以作为经济拮据患者接受PGD助孕的首选方案。但是由于样本量较少，仍需积累更多的病例进行临床研究，补充妊娠结局相关数据，为临床上PGD患者促排卵方案的选择提供更多理论依据。
[参考文献]
[1]KuangY,HongQ,ChenQ,etal.Luteal-phaseovarianstimulationisfeasibleforproducing
