前言
促卵泡刺激素(FSH)和促黄体生成素(LH)这两种促性腺激素在脊椎动物的下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴中起主要作用。鱼类促性腺激素是由两个非共价结合的亚单位组成的结构异二聚体糖蛋白。一个共同的α亚单位是非共价的，但可连接到一个特定的β亚单位，它决定了激素的生物活性和特异性。两个亚基都有两个N-连接的糖基化位点和相似的拓扑结构，其中半胱氨酸是中心基序。这种结构是由分子内的二硫键维持稳定的。每个亚单位：α，FSHβ和LHβ由一个不同的基因编码。为了获得有功能的促性腺激素，两个亚基必须组装在一起。因此，利用分子生物学方法，通过将其α和β亚基基因合并在一个单一序列中，成功地开发出了具有连接链的单链促性腺激素类似物。最有效的连接体是三个甘氨酸-丝氨酸重复序列，目前用于生产重组鲤鱼FSH。以前对鲤鱼的研究发现，在产卵前几个小时，血浆中的GTH水平会增加，而在产卵季节，GTH水平会出现季节性波动。由于大多数研究都是在鉴别两种不同的GTH激素(LH和FSH)之前进行的，因此缺乏FSH的活性及其分泌模式。
在本研究中，描述了利用P.pastoris系统构建重组鲤鱼FSH(rcFSH)和LH(rcLH)，以及针对各自β亚基的特异性抗体的生成，以及它们在各自免疫分析(ELISAs)的开发和验证中的应用。进一步利用这些酶联免疫吸附试验研究了它们在成熟雌鲤鱼中的年谱和特异性新抗体；并对鲤鱼及其分类近亲斑马鱼垂体内促性腺激素的结构进行研究。
结果
重组鲤鱼促性腺激素的表达及三维模型
纯化的6-His重组促性腺激素在还原条件下进行SDS-PAGE；用抗His抗体进行检测。只有在用PNGaseF去糖基化后才能检测到特异性条带，而糖基化蛋白则出现涂片，这可能是由于糖基化率的高变异性。rcLHβα和rcFSHβα分别显示30kDa和25kDa条带，以及一个更小尺寸的涂片，可能是由于蛋白质降解。rcLHβ和rcFSHβ分别呈现22kDa和17kDa条带。猜测出现在~30kDa的额外条带是PNGaseF，它对6-His抗体有较弱的作用。仅用PNGaseF对抗体进行Westernblot检测时出现了相同的条带(数据未显示)。在rcLHβ的情况下，~30kDa处的条带更强，可能反映了蛋白质的新形式。单独用载体转化作为阴性对照，不产生条带（数据未显示）。
比较了三种测定重组蛋白浓度的方法：第一种是直接测定nm处的吸光度；第二种是使用6-His-ELISA的商业试剂盒；第三种是特异性的同源竞争ELISA方法，分别用新的抗rcLHβ或rcFSHβ的一级抗体和rtLHβα或rtFSHβα作为标准曲线。吸光度法直接测定蛋白质含量快速方便，但以nm处的吸光度法测定的蛋白质含量最高。事实上，cLHβ高出19倍，cFSHβ高出5倍（表1）。6-His或GTH特异酶联免疫吸附分析所估计的蛋白质数量具有相同的数量级。ELISA结果更可靠，更能反映重组蛋白的真实浓度，因此，下一步所有的蛋白质估算都是基于这些免疫分析。
表1三种不同方法测定重组蛋白浓度;采用分光光度计、6-His特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)和本实验室开发的鲤鱼GTH特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)检测OD水平
鲤鱼lh和fsh在鱼垂体中均有高表达。在大脑中也发现了低水平的促性腺激素mRNA。lh水平比fsh高3个数量级。
由I-TASSER产生的cFSH、cLH和亚单位α和β构象叠加在PDB数据库提取的具有代表性的hGTHs的现有结构。根据hGTHs的模型，人工构造了完整的rcLHβα和rcFSHβα蛋白模型（图1）。rcFSH和rcLH在现有hGTH结构上的叠加显示rcGTHβ亚单位、hCG和hFSH之间高度相似，主干均方根偏差（RMSD）为0.92–2.46A。hCG结构1QFW的RMSD值最低（2.46?和1.14?对于rcFSHβ和rctLHβ），而hFSHβ结构1FL7是rcFSHβ的最低RMSD值（0.92?）和rcLHβ（1.40?）。GPα给出的RMSD值为1.08?当叠加在hFSH结构1XWD，和1.02?当叠加在hCG结构上时为1QFW。
图1重组鲤鱼促性腺激素模型。重组鲤鱼FSH和LH的三维结构模型。促性腺激素亚单位呈带状分布。重组GTHs表达为单链多肽，含有一个带有6-His标记的连接子和三个甘氨酸和丝氨酸分子（三个Gly-Ser）。使用I-TASSER服务器进行建模
cFSH和cLHELISA的验证
FSHELISA的标准曲线范围为19.53pg/ml~10ng/ml,LHELISA的标准曲线范围为10.67pg/ml~ng/ml。cFSH和cLH的标准曲线的R2值分别为0.94和0.98，而cFSH和cLH的灵敏度（检测下限）分别为7.54pg/ml和32pg/ml。FSH酶联免疫吸附试验中，同一样品在同一平板上的测定内变异系数(CV)为1.06%(n=8)。同一样品在不同平板上的批间变异系数为8.66%（n=5）。对于LHELISA，同一平板中相同样品的批内CV为7.6%（n=8）。同一样品在不同平板上的批间CV为11.3%（n=7）。
平行性是用于生物样品的分析验证的第一步，其中样品的稀释度根据标准曲线绘制并测试。通过标准品（rcLHβα和rcFSHβα；图2A和B）的连续稀释获得的线；发现生物样品（垂体，CPE）平行运行，这意味着抗体识别的分析矩阵是相容的。此外，鲤鱼LH-ELISA的标准曲线与从各种鲤鱼物种，如青鱼（Mylopharyngodonpiceus）、金鱼（Carassiusauratus）、鲢鱼（Hyphalmichthysmolitrix）和草鱼（Ctenopharyngodonidella）垂体提取物连续稀释获得的位移线平行（图2C）。平行性只检测到LH，因为所有鲤鱼的垂体中FSH的含量都低于检测水平。
图2重组鲤鱼促性腺激素与天然鲤鱼促性腺激素的平行性。鲤鱼LH（A）或FSH（B）与鲤鱼垂体提取物（CPE）ELISA标准曲线间的位移线。鲤鱼LH-ELISA标准曲线与鲤鱼脑垂体提取物系列稀释液位移曲线的平行性：青鱼（Mylopharyngodonpiceus）、金鱼（Carassiusauratus）；鲢（Hypophthalmichthysmolitrix）和草鱼（Ctenopharyngodonidella）（C）
年度概况和卵巢发育
GSI、卵泡直径、FSH和LH的mRNA和蛋白水平均出现明显的年度周期性变化。在进行抽样的一年中，我们确定了两个鲤鱼种群，根据它们的GSI值进行分类，尽管它们的体重没有显著差异：大GSI和小GSI分别为1.43kg±55.14和1.34kg±53.55（图3A）。
9～11月，所有鱼类GSI均较低（2.11%）；从组织学上看，卵巢中含有前生卵泡，这两个群体无法区分。从12月开始，出现了两个不同的群体，GSI高或低。GSI较低的雌性鱼，虽然体型相同，但其性腺发育可能延迟，因为GTH的分布与卵黄发生前和卵黄发生早期的鱼一样。随后，GSI增加，并在12月达到峰值（10.5%），在1月至3月保持较高水平，卵泡直径达到.3mm，卵巢含有大量成熟卵泡（图3A和4）。此后，GSI逐渐下降，可能是由于4月开始产卵，一直持续到5月。它再次增加，达到6.65%，卵泡直径达到μm，组织学显示中卵黄形成卵泡（图3）。在GSI较低的组中，年内没有发生显著变化（图3）；卵泡直径全年约为μm。GSI与卵泡直径呈正相关（r=0.8；p0.；图3C）。
垂体促性腺激素亚单位mRNA水平的年度分布与各自的卵巢阶段有关-从卵黄发生前的卵泡到卵黄发生早期和中期，直到准备产卵的卵泡（图4）。垂体中FshβmRNA水平在不同的卵巢阶段没有显著变化。另一方面，在成熟性腺中，lhβ的表达在卵黄形成中期结束时显著升高（图4A）。FSH和LH含量也有相似的变化。在产卵前的成熟卵泡期，FSH含量没有明显变化，而成熟雌性的LH含量增加（图4B）。在整个年周期中，fshβmRNA和垂体绝对含量均低于lhβ（图4）。
图3从年9月到年8月，每月对鲤鱼雌性进行抽样调查。在GSI中，每个点代表同一个月收集的个体的平均值（5n10，0.SE1.）。根据其GSI值将取样鱼类分为两个种群：GSI值大、GSI值小的鱼类。HE染色的代表性组织切片在每个月下出现。性腺体指数（GSI；A）；在卵泡直径（B）中，每个点代表一个个体的10个卵泡的平均值，红线表示同一个月所有个体的平均值。用Pearson系数（R2=0.64，n=76）进行GSI与卵泡直径（C）的相关试验
图4鲤鱼垂体中FSH和LH的年度分布：每月采集8～10只雌性鲤鱼，其中一半进行mRNA表达分析，另一半进行ELISA直接激素测定。(A）实时荧光定量PCR检测LHβ和FSHβmRNA表达随GSI值和发育阶段的变化。通过比较阈值循环法将mRNAs的相对丰度标准化为延伸因子1α（Ef-1α）的量。垂体LHβ和FSHβ蛋白水平的变化与GSI值和特异性ELISA测定的发育阶段有关。LH值以mg/垂体表示，FSH以ng/垂体表示（B）。结果以mean±SEM表示（n=3–5）。不同字母标记的平均值差异显著（P0.05）。（PG）初级生长，（PV）原发性，（EV）早期卵黄形成，（MV）中期卵黄形成，（MF）成熟卵泡
为了探究基因表达与所测内分泌和生理变化之间的潜在关系，创建了一个全因子相关矩阵(表2)。GSI与卵泡直径呈强正相关(图3C;表2)。卵泡直径与垂体黄体生成素含量、lhβmRNA水平呈正相关(r分别为0.39和0.32)。然而，卵泡直径与fshβmRNA水平或FSH垂体含量之间没有显著相关性(表2)。fshβ和lhβmRNA水平显著相关，而两种促性腺激素垂体蛋白含量无显著相关(表2)。
表2雌鱼垂体中FSH和LH表达水平、垂体中FSH和LH含量、GSI和卵泡直径年周期变化的相关性分析
鲤鱼LHβ和FSHβ抗体的垂体免疫组织化学研究
为了进一步验证针对重组cFSHβ和cLHβ的特异性抗体，以及鉴定每个GTHs在鲤鱼脑垂体中的特异性定位，使用了新的特异性抗体进行双重免疫化学染色。同时包含大脑和垂体的切片可以通过其方向和组织结构识别腺体的不同区域(图5)。卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)细胞均定位于近端远端部中心(PPD)，包围两侧神经垂体(NH;图5A-C)。虽然这两种激素似乎在同一区域表达，但更仔细的检查发现，在表达LH和FSH的细胞之间有很小程度的重叠，而且每种激素在不同的促性腺激素细胞中表达，这在其他鱼类中也有报道（图5D）。卵泡刺激素细胞数明显低于黄体生成素细胞。
图5鲤鱼重组促性腺激素特异性抗体免疫荧光双重染色。绿色的FSHβ亚单位（A）和品红的LHβ亚单位（B）。（A）和（B）的合并显示两种促性腺激素都在PPD（C）中表达。（C）中的方框区域标记（D）中的图像区域，黄线标记特定垂体的边缘。PI——中间部；RPD——嘴端远端部；PPD——近端远端部；NH-神经垂体。每种促性腺激素都在不同的细胞亚群中表达（D）。比例（A–C）-μm，（D）-90μm
近几十年来，斑马鱼成为重要的模式物种。为了进一步验证抗体的特异性和反应性，在FSH启动子和m-cherry的调控下，在LH启动子的调控下，对表达GFP的转基因斑马鱼垂体切片进行免疫化学染色。每一种抗体染色的共定位，以及同一激素的荧光报告基因的表达模式，显示两者之间有很高的重叠(图6C和F)。抗体染色和荧光报告基因的模式之间存在微小差异，因为报告基因的信号强于抗体染色;后者只绑定到薄片的外层。如鲤鱼所示，两种GTH都在PPD中表达。在携带这两种转基因的双标斑马鱼中，这两种细胞类型很容易识别，并且每种标记的促性腺激素只显示一种类型的荧光报告基因。
图6转基因斑马鱼的抗体验证。表达FSH-GFP（A）和LH-m-cherry（D）的转基因斑马鱼垂体，用针对鲤鱼重组FSHβ亚单位（b）和LHβ亚单位（E）的特异性抗体进行免疫荧光染色。每种抗体与其各自的转基因系FSH（C）和LH（F）的融合显示两种信号的高水平共定位。（C）和（F）中的黄线表示特定区域的垂体边界。PI——中间部；RPD——嘴端远端部；PPD——近端远端部；PN–神经部。比例–50μm
结论
早期的研究发现斑马鱼FSH被报道特异性激活FSH受体，而斑马鱼LH可以同时刺激FSH-R和LH-R。如果鲤鱼也是这种情况，那么可以假设两种鲤鱼体内高水平的LH可能足以通过刺激LH-Rs和FSH-Rs在生理上激活卵巢，而低水平的FSH不会阻碍正常繁殖。因此，应该明确卵泡直径与垂体LH含量及其转录水平呈显著正相关，而与垂体FSH含量或mRNA水平无关。综上所述，这些结果表明，在鲤鱼中，LH单独就足以调节鲤鱼卵黄发生和最终成熟和排卵，而FSH则有另一个未知的作用。
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