JournalofProteomeResearch最新发表了赛默飞与上海市食品药品检验所生物制药合作研究成果——人促卵泡激素(hFSH)糖基化结构解析。

人促卵泡激素是一种糖蛋白药物，在生殖系统的发育和功能中起着关键性的作用，并在临床上用来促进体外受精过程中的排卵期妇女的卵泡成熟。该蛋白由α和β亚基非共价组成异二聚体，并且在每个亚基上都含有不同类型的糖链结构。这些寡糖链决定着hFSH的药理学特征，包括稳定性、溶解度、体外活性、药代动力学以及免疫原性。

糖基化为非模板合成的二维结构，离子化效率差、糖苷键易碎，质谱解析极为困难。此外，O-糖结构不具N-糖那样明显的规律性，也没有类似PNGaseF这样的内切酶释放糖链，因此，O-糖蛋白质谱分析可谓是蛋白质谱分析的珠峰登顶，难度极大。

本研究借助Orbitrap超高分辨质谱对常用的两种人促卵泡激素——尿源的uhFSH和CHO细胞重组表达的rhFSH进行糖基化结构解析和对比。利用高能碰撞裂解(HCD)和电子转移裂解(ETD)相配合的独一无二的HCDpdETD流程，成功解析了两种hFSH的N-糖基化结构，并发现了尚未报道过的O-糖基化位点和相应O-糖链结构，为hFSH的功能机理研究和药物质量控制奠定基础。

1.技术流程与总体糖基化水平分析

为了更精确、更全面的解析uhFSH和rhFSH糖基化，实验使用了以高分辨质谱为主的多种糖蛋白质组研究策略，进行了完整分子量、唾液酸含量、N-糖基化位点和结构、位点特异性N-糖基化和O-糖基化等全方位分析(图1a)。

尽管uhFSH和rhFSH分子量非常接近，但高分辨质谱数据表明二者糖基化具有明显差异，且uhFSH的糖基化结构要比rhFSH更加复杂、多样(图1b)。IEF结果表明uhFSH唾液酸化程度更高(图1c-d)。高分辨二级谱图鉴定到了hFSH的N-糖基化位点并发现位点存在部分糖基化现象(图1e)。

2.N-糖链定性与定量比较

使用HPLC对uhFSH和rhFSH释放的N-糖链进行了定性和定量分析。如图2a所示，两者来源的FSH展示出了完全不同的糖型和结构。图2b则罗列出显著差异结构在二者之间的相对丰度。

进一步对重要的N-糖链进行Orbitrap超高分辨质谱MS/MS分析，在rhFSH中发现含有NeuGc化、岩藻糖化及硫化的结构(图3a-3b)，而uhFSH中含有二分型结构和岩藻糖化的异构体(图3c-3d)。

3.O-糖基化的发现

O-糖缺少像N-糖一样的保守序列和结构规律，使得O-糖的发现和解析非常困难。然而，通过HCDpdETD模式，这一难题得以轻松解决。HCD的数据含有所有的糖链信息，而ETD包含着与HCD互补的肽链骨架信息。通过这一技术，首次在uhFSH中发现5个O-糖基化位点，rhFSH中发现3个O-糖基化位点，大多数糖基化位点均是综合HCD与ETD两种碎裂方式的信息所鉴定到；其中β亚基上T6(HexNAc1)的O-糖基化修饰，虽然紧邻一个N-糖基化修饰，但仍然能够通过HCD的碎片鉴定到，证明Fusion的多种碎裂方式在进行糖基化分析时，可以获得足够多的信息进行糖肽的全面解析(表1、图5)。

小结

本研究使用了多种技术手段对比研究了uhFSH和rhFSH的N-糖基化：uhFSH中有较高水平的唾液酸、多天线和宏观不均一性，而rhFSH则有较高水平的NeuGc和硫化。本研究首次阐明了hFSH中的O-糖基化位点及组成，为后续更加深入的研究糖基化对二者功能、稳定性、半衰期等方面的影响提供了理论基础。

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