原著：ANetworkofNoncodingRegulatoryRNAsActsintheMammalianBrain

作者：DavidP.Bartel实验室BenjaminKleaveland等4人

出版：Cell年6月7日在线

Cyrano：长非编码RNA,出生于2号染色体，主要定居于细胞质，在脑和肌肉组织中富集（比其他组织高5-10倍）；含有一段脊椎动物中高度保守序列，该序列与另一名主角miR-7几乎完全配对（除第9/10位外）；在斑马鱼中用morpholino（一种修饰的核苷酸序列）敲低Cyrano或者堵住其与miR-7结合的保守序列后，斑马鱼神经发育出现多种异常，鼻板明显偏大，因而得名Cyrano，即大鼻子情圣（注释见后）。miR-7:微小非编码RNA，神经和神经内分泌器官细胞中高表达，小鼠中有3个姐妹，miR-7a-1,miR-7a-2和miR-7b;miR-7a-2敲除的雌雄小鼠皆有不育表型，睾丸与卵巢偏小，原因是垂体中卵泡雌激素（FSH）和促黄体生成素（LH）分泌减少；另外miR-7a-2敲除在胰岛beta细胞中导致葡萄糖刺激的胰岛素分泌升高，而胰岛中特异过表达miR-7a则导致糖尿病。

Cdr1as：环形非编码RNA,虽然不是第一个报道的环形RNA，却是当之无愧的明星分子，短短约3kb的序列上带有个miR-7的结合位点（人中CDR1as约1.5kb,带有73个miR-7结合位点）；因为他的这些杰出特点，环形RNA曾被认为主要通过miRNA海绵（miRsponge）的形式抑制miRNA发挥作用，但事实上大自然没有人类那么无聊，大多数的环形RNA都不具备Cdr1as这种结合几十个miRNA的能力，而即使是Cdr1as,是否是通过miRsponge抑制miR-7的功能还是贮藏并将miR-7运输到神经细胞特定位点（如突触）都还没有定论。敲除了Cdr1as的小鼠出现了感觉运动门控的缺陷，其大脑不能过滤掉无效刺激的信息（如窗外重复单调的噪音），出现类似于人类精神分裂症或心理疾病患者所具有的神经紊乱症状、过渡警觉、辨别困难（开个玩笑，正好比是如正处于tenure评审前期的PI）（环状RNA领域的一项重大进展）。

miR-：微小非编码RNA,也许是本剧中的最卑微的角色，却是结束Cdr1as环形生命的终结者，与Cdr1as上一段序列互补，由于互补程度太高，导致触发哺乳动物甚至脊椎动物中都少见的miRNA介导的Ago2剪切RNA的现象，将Cdr1as变为线性RNA，稳定性降低而降解。

年Bartel实验室的研究发现Cyrano在斑马鱼早期胚胎神经发育中有非常突出的表型。鉴于Cyrano的保守性，他们想要知道其是否在哺乳动物如小鼠中会有类似的功能，于是充满希望地构建了Cyrano敲除的小鼠。然而悲剧的是，敲除了Cyrano的小鼠活蹦乱跳，出生率正常，没有大鼻子（更不会写诗，想知道这个梗，请看注释），也没有神经发育方面的异常。失望之余，研究人员机智地转向分子表型的研究，于是成全了本篇Cell的佳话。

场景一

首先基于Cyrano有一个非常保守的miR-7的结合位点，作者分析了miR-7在敲除小鼠组织中的表达，发现在小脑，海马等组织中Cyrano的敲除导致了miR-7的显著升高（小脑40-47倍，海马6-7倍），且miR-7的升高倍数与所在组织中的Cyrano的表达量成正向相关，这种调控至少在人的细胞系中也存在。进一步研究发现，Cyrano介导miR-7的降解，通过所谓TDMD,即target-directedmiRNAdegradation（靶标介导的miRNA降解机制），过去发现的TDMD的turnover大约0.1-1，然而Cyrano介导的机制turnover却可以达到~17（个分子导致~个分子降解），但是具体的降解机制不清楚。其实作者在这方面也下了一番功夫，他们集中研究了miR-7的tailing（加尾，加上U或者A的现象）和trimming(截短）的现象，发现Cyrano的确调控这些过程，加尾是通过GLD2来达成的，本以为是通过这个机制来调控其稳定性的，但是很不幸不是,而截短和降解的相关性及机制则没有进一步研究下去。该场景以悲剧开始，喜剧衔接，又以悲剧收尾。

场景二

既然搞不定Cyrano降解miR-7的机制，不如看看miR-7的升高会导致什么混乱吧。于是作者解析了在Cyrano敲除组织中miR-7升高是否导致了相关RNA靶标的降低，虽然在野生和敲除小鼠脑组织中测序的结果显示在总体上有靶标降低的趋势，但是真正具有显著差异的靶标非常少，在小脑中只有一个Cdr1as受到影响,大约降低10倍左右。Cdr1as的升高与miR-7有关还是Cyrano的其他功能导致的呢？通过miR-7a-1,miR-7b的双敲除小鼠和Cyrano敲除杂交发现，当miR-7被敲低后，即使Cyrano缺失的情况下，Cdr1as也不再降低，说明miR-7是导致Cdr1as降低的罪魁祸首。然后通过免疫荧光原位杂交（FISH）分析Cyrano和Cdr1as的定位发现，二者主要位于细胞质和突起中，并且Cyrano敲除后细胞质和突起中而不是细胞核中的Cdr1as降低，说明降解的位置是在细胞质中。本场景说明Cyrano和Cdr1as是朋友，Cyrano与miR-7则是敌人，当然Cdr1as是miR-7的敌人，朋友还是更为复杂的恋人关系，尚无定论。

场景三

那么miR-7是如何降低Cdr1as的呢？之前的研究在细胞中发现miR-通过Cdr1as上的互补位点介导Ago2作用的剪切和降解，通过构建Cdr1as-位点突变的小鼠，作者发现在小鼠组织中（cerebellum和cortex）同样存在该位点导致Cdr1as降解的现象，通过Cyrano敲除和Cdr1as-位点突变动物的杂交，作者发现除了通过miR-的降解机制外（大约3-5倍），还有其他未知的机制（大约2-3倍）。本场景说明miR-的互补位点在miR-7介导的Cdr1as的降解过程起重要作用，但是有其他未知机制。另外由于没有采用miR-敲除模型，因此是否直接通过miR-降解Cdr1as并无证据，但在以往发表的结果的基础上，做出此推论应不为过。

在小鼠脑中，特别是小脑和海马等组织中，长非编码RNACyrano通过一种未知的机制促进微小非编码RNAmiR-7的降解，从而达到保护另外一个环形非编码RNACdr1as的作用，而miR-7在Cyrano敲除细胞中的升高会导致Cdr1as的显著降低，作用机制通过miR-的互补位点以及其他未知作用。鉴于文中所涉及的几个分子在不同的场景中均有重要发育及行为学上的表型，本文中的无明显表型着实让人意外，预计作者们会继续以更精细的方式分析，后续可能会有更多惊喜。本文的逻辑非常缜密，分析细致入微，比如在研究Cyrano降解miR-7的现象时，排除了通过转录和微小RNA生成途径的影响，而在分析Cdr1as受miR-7和Cyrano的调控时，精确到了亚细胞定位，排除了核中Cdr1as所受影响。语言功底也非常深厚，尽管所描述的事件和分子较多，但读来未有错乱之感。

本研究的发现亮点在于揭示了一个完全由非编码RNA所组成的分子调控网络，发现了TDMD也可以有高turnover的现象，以及环形RNA的降解可能存在未知的新机制。本研究的技术亮点在于充分利用敲除小鼠模型，包括Cyrano敲除，Cyrano位点突变，miR-7a-1/miR-7b双敲除，Gld2敲除，Cdr1as-miR-位点特异突变，采用定量而不是简单定性分析，如Cyrano和miR-7的拷贝数变化的分析，以及miR-位点在miR-7降解Cdr1as作用中所占比例的分析。而文章的可疑之处似乎也在后者，一般动物的数据误差都较大，但本文中所出示的不同动物的差距极小，不知是所用动物数目偏小之故还是其他原因。

证明Cyrano通过与miR-7互补的保守序列介导miR-7的降解时，不仅有敲除的数据，还有直接突变互补序列的小鼠模型和数据分析。（下图）

证明细胞质和突起中而不是核中Cdr1as被降解的实验。（下图）

证明miR-7降解Cdr1as通过miR-位点依赖和不依赖机制的实验中，将Cyrano敲除与miR-位点突变的Cdr1as小鼠杂交，并未能完全恢复Cdr1as的水平。（下图）

没有宏观的表型可能是很多生物学研究人员的噩梦，但其实分子层面的表型也非常重要。如果能够采用本文中的认真态度，以近乎追问到底的方式层层递进分析，当然也可以成就佳篇。这些分子层面的探讨，引发新的现象，不仅可以帮助继续挖掘宏观层面的表型，还有可能带来新的靶标。如本文中TDMD的机制和环形RNA的降解机制，预计后续必定有重要发现。

[注]Cyrano的由来：大约年的时候，Bartel的实验室发现一个高度保守的长非编码RNACyrano（西哈诺）在斑马鱼敲除之后导致神经发育异常并且鼻板偏大，该ncRNA的命名也由此而得。Cyrano,大鼻子情圣，是法国剧作家罗斯丹所创作同名戏剧中的主角。西哈诺是一名优秀的军人，敢于以一敌百，同时也是一名才华横溢的诗人，唯一的缺陷是有一个大鼻子；出于自卑与敏感，他只得把对漂亮表妹罗克萨娜的爱情埋藏在心底，甚至通过代写情书和诗歌成全了自己的下级克里斯蒂安与罗克萨娜的好事，直到临终前才得到了表妹的爱情。作者罗斯丹是一位理想主义者，他认为“生活不能没有理想没有目标，也许这个理想你永远也无法实现，但是在努力去实现它的过程中，我们就使生活变得美好与高贵”。

参考文献

1.Kleaveland,B.,Shi,C.Y.,Stefano,J.Bartel,D.P.ANetworkofNoncodingRegulatoryRNAsActsintheMammalianBrain.Cell,doi:10./j.cell..05.().

2.Ulitsky,I.,Shkumatava,A.,Jan,C.H.,Sive,H.Bartel,D.P.ConservedfunctionoflincRNAsinvertebrateembryonicdevelopmentdespiterapidsequenceevolution.Cell,-,doi:10./j.cell..11.().

3.Ahmed,K.etal.LossofmicroRNA-7a2induceshypogonadotropichypogonadismandinfertility.TheJournalofclinicalinvestigation,-,doi:10./JCI().

4.Latreille,M.etal.MicroRNA-7aregulatespancreaticbetacellfunction.TheJournalofclinicalinvestigation,-,doi:10./JCI().

5.Piwecka,M.etal.LossofamammaliancircularRNAlocuscausesmiRNAderegulationandaffectsbrainfunction.Science,doi:10./science.aam().

6.Hansen,T.B.etal.miRNA-dependentgenesilencinginvolvingAgo2-mediatedcleavageofacircularantisenseRNA.TheEMBOjournal30,-,doi:10./emboj..().