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生物样本库BS小组
背景：随着年轻癌症患者数量的增多，人们越来越重视患者癌症治疗后的生活质量。据美国癌症协会报告，年在美国大约有名女性被诊为癌症，其中，有1/的患者处于生育年龄。癌症治疗可能会导致育龄患者不孕、不育，并且长期影响女性患者的骨骼健康，心血管健康及内分泌功能。许多年轻的癌症患者认为保存生育能力的重要性仅次于延长寿命。
方法：提高改进保存生育能力的技术旨在帮助癌症患者在化疗或放疗之前保护她们的生育能力，从而使她们获得拥有家庭的机会，提高癌症患者的生活质量。目前，精子库，卵子库及胚胎库是保存处于生育年龄的癌症患者生育能力的规范机构，但是卵巢组织冷冻保存技术仍处于实验研究阶段，癌症患者也可考虑收养和代孕。
结论：所有的癌症患者应及时被告知癌症治疗对其生育力的影响，从而决定是否最终保存生育力。由于癌症治疗和保存生育能力需求的不断增加，精准医学使患者了解癌症治疗对生育能力的影响的同时也为癌症患者提供保存生育能力的机会。
全文摘要及图解：
由于女性内分泌功能和生育能力依赖于周期性卵巢卵母细胞的储备。因此,保护卵巢储备是保护女性生殖健康所必需的。不幸的是，肿瘤化疗和放疗在消除癌细胞的同时破坏卵巢卵母细胞的增长，也影响卵巢储备的卵母细胞而导致死亡或异常活化，卵巢储备的损耗影响了正常的内分泌功能和激素的分泌，从而导致激素水平失衡。
本文将回顾讨论在女性癌症患者中保存女性生育力的各种现有技术和新兴技术进展，目的是可以根据患者对癌症治疗和生育力保存需求，选择个性化治疗，从而体现精准医疗。
一、育龄期女性生殖细胞对肿瘤放化疗毒性治疗的影响：（图1）
在肿瘤放化疗中，卵泡细胞受损的程度取决于放化疗所选择的类型和剂量。卵母细胞是人体最敏感的细胞，50%的人类未成熟卵母细胞可以暴露辐射剂量为2Gy。针对儿童腹腔放射剂量20到30Gy或全身放射剂量15Gy的情况下会导致大于90%的女性患者卵巢功能丧失（卵巢功能早衰，POF）和不利风险增加。化疗药物包括烷基化代谢物如环磷酰胺或白消安（二甲磺酸丁酯）等不仅影响全身组织的体细胞也影响卵母细胞和卵泡细胞生长发育。
图1：育龄期女性生殖细胞毒性治疗结果
(A)原始卵泡数可以通过女性寿命线来表示，从女性青春期至更年期，每个月经周期发生原始卵泡从激活到死亡。卵泡的每个生长周期保持女性健康所必需的激素平衡。性腺应激或化疗和放射治疗(图中红线所示)，导致原始卵泡迅速减少(A、C)，最终导致卵巢卵泡耗尽(B)和卵巢早衰(POF)。卵巢储备的损耗影响了正常的内分泌功能和激素的分泌，如促卵泡激素(FSH)，促黄体激素(LH)，雌二醇，黄体酮，抑制素B，抑制素A(D)，从而导致激素水平失衡，激素水平类似绝经期女性。
二、目前现有保存患者生育力的技术方法：（图2）
女性被诊断出患有癌症，生育保护现有两种选择：成熟的卵母细胞的冷冻保存或胚胎的冷冻保存。卵巢组织冷冻保存用于移植仍处于实验阶段，只能执行IRB的批准。选择最优方法保存生育能力取决于癌症治疗的时间以及治疗方案、癌症类型、患者的年龄、是否有伴侣等。
1、胚胎冷冻保存：（图2A）
胚胎冷冻保存是不孕不育的临床应用最广泛的方法，每年成千上万的婴儿来自于冷冻胚胎。人类胚胎通过冻存是高度抗损伤的，据报道存活率和移植率分别超过90%和30%。此外，每个胚胎移植的存活率据报道约20%。因为完整的胚胎冷冻保存过程需要大概2周的时间，这对于侵袭进展性癌症和必须立即开始治疗的女性癌症患者并非合适的选择。
2、卵母细胞冷冻保存：
年，美国生殖医学协会和生殖技术协会共同宣布现代卵母细胞冷冻保存程序不应再被视为实验[16]。这种方法对于那些没有伴侣或不想使用捐献精子的女性提供了一种替代胚胎冷冻保存的方法。此外，低温冻存卵母细胞对于女性来说是合乎伦理的，从而避免了关于冻存胚胎的复杂监护权问题。然而,卵母细胞的冷冻保存涉及卵巢刺激激素（COS），所以这个方法不适用于需要立即治疗的侵袭进展性女性癌症患者，或激素敏感肿瘤及青春期前的年轻女性。收集的卵母细胞可为低温冻存的成熟MII卵细胞或未成熟胚囊泡(GV)卵母细胞。
（1）成熟的卵母细胞冷冻保存：
人类第一个来自低温冻存的卵母细胞孕育的生命是年由chen报道[17]。由于不断改进冻存技术，低温冻存卵母细胞的怀孕有效率有了较大的改善。目前，冻存卵母细胞的高存活率(≥90%)和怀孕率(40%-55%)已在卵子捐赠计划中报道[18]。一系列的研究表明，来自低温冻存成熟卵母细胞与新鲜的卵母细胞相比，在怀孕率和胚胎移植率上几无差别，据报道染色体异常也无明显差异[19]。
（2）未成熟卵母细胞冷冻保存和体外成熟培养：
体外成熟培养未成熟的卵母细胞是对于那些无法接受卵巢刺激，包括青春期前的女孩，激素敏感性女性肿瘤患者，多囊卵巢综合症(PCOS)患者由于卵巢过度刺激综合症无法接受卵巢刺激。
3、用于胚胎或成熟卵母细胞冻存的卵巢刺激方案：
（1）随时启动卵巢刺激方法：
在传统的胚胎或卵母细胞冷冻保存流程中，整个周期超过5周，因为卵巢刺激必须在月经周期的2-3天启动，(图2A)。在大多数病例中，这个时间是合适的，因为许多患者进行化疗或放疗前切除肿瘤。也就是说一些病人需要开始癌症早治疗，因此研究出随时启动卵巢刺激方法。在这个过程中，卵巢刺激不分月经周期的时间段。这个随机启动方法是基于最近的概念关于在单个排卵周期有很多的卵泡成熟[28]。该方法可行因为其目的是从卵巢获取成熟的卵子而不需要完整成熟的子宫。此方法保证患者及时治疗,使更多患者在放化疗之前进行卵子或胚胎冷冻保存而保留生育能力。
（2）在激素依赖肿瘤患者中使用芳香化酶抑制剂或他莫昔芬：
对激素依赖性肿瘤患者，如乳腺癌，可以尝试在自然生理周期获取成熟的卵母细胞而避免在超出雌激素生理水平之上卵巢刺激时期。然而，据研究此法收集卵母细胞的数量很低。常用的方法是从周期第2-3天使用5毫克的来曲唑，随后使用促性腺激素。来曲唑的使用并不影响卵母细胞的数量，但在一些研究报道在来曲唑使用周期卵母细胞成熟率较低。本方法仅用于将获得的卵母细胞冷冻保存，随后病人可以继续她们癌症治疗计划。
4、卵巢组织冷冻保存：
卵巢组织冷冻保存-相对于卵母细胞或胚胎冻存而言，不需要卵巢刺激、不必推迟癌症治疗的开始、不需要伴侣或精子捐献。卵巢组织冷冻保存可能是单身女性不希望使用捐赠的精子或青春期前的女孩保存生育力的最佳选择。然而，这个过程是有创性的，需要全身麻醉和手术切除卵巢组织。此外,还有医疗中心在此过程经验相对较少。因为保留在卵巢闭锁卵泡内未成熟的卵母细胞是具有年龄相关性的，此方法不适用于39岁以上妇女。一旦切除，卵巢组织包含多个卵泡经低温冻存，可以备以后复苏，通常采用两种途径：（1）给肿瘤幸存者移植复苏卵巢组织或（2）隔离复苏的卵泡细胞体外培养，体外生长、成熟、受精(图2c)。卵巢移植后存活率低的主要原因是冷冻受伤和缺血性损伤。
5、保护剂辅助治疗
患者在癌症治疗期间，通过使用保护剂使生殖细胞毒性减轻，保护剂在杀死肿瘤细胞的同时减少化疗对其他组织细胞的影响，从而保护女性癌症患者的生育能力及内分泌功能。最近，促性腺激素，释放激素受体激动剂在化疗中使用来降低癌症治疗过程中对卵泡生长及其封闭卵母细胞的毒性作用。
图2：保留癌症患者生育能力的技术方法
每一个步骤都有箭头表示，黑色为已经证实，蓝色为临床实验研究中。（A）患者自然形成或体外反复刺激形成卵细胞，可运用IVM技术体外成熟，或者运用冷冻，体外受精（IVF）或卵胞浆内单精子注射（ICSI）形成胚胎，然后将其冷冻保存。那些不能保留卵巢组织的患者（包括青春期前的女性及激素敏感性肿瘤患者），或者必须立即开始癌症治疗的患者，提取卵巢皮质或组织中的单个卵泡细胞冻存。研究的重点是将复苏的卵巢组织移植入体内和卵泡细胞体外培养，其次是IVM和IVF/ICSI技术。（B）患者在癌症治疗期间，通过使用保护剂使生殖细胞毒性减轻，保护剂在杀死肿瘤细胞的同时减少化疗对其他组织细胞的影响，从而保护女性癌症患者的生育能力及内分泌功能。（C）癌症治疗结束后，可以将复苏冻存的的胚胎移植到患者子宫内，或将卵细胞复苏用于IVF/ICSI技术，再将获得的胚胎移植入患者子宫。在临床试验方面（蓝色箭头），冻存的卵泡细胞可以在体外培养，成熟，经受精卵发育成胚胎应用于移植技术。卵巢可以重新移植回患者体内，也可以提取卵泡细胞用于形成胚胎或在培养体系中继续培养作为人造卵巢重新植入患者体内。癌症治疗后移植的卵巢组织或者人工卵巢组织内的卵泡具有恢复生育能力以及内分泌功能的潜力。
（D）针对在肿瘤治疗前无法冻存卵细胞，胚胎或卵巢组织的癌症患者，研究人员正在探索使用卵原细胞干细胞以重新填充卵泡储备不足的卵巢，或从胚胎干细胞分离卵泡体细胞和卵母细胞或者诱导多能干细胞以重获卵泡用于移植，或者用于体外受精技术培育胚胎用于移植技术。
三、保存患者生育力的新技术进展：
1、体外培养卵泡细胞
一些被诊断出患有急性淋巴细胞白血病或急性髓系细胞白血病(AML)的癌症患者，由于他们不能延迟治疗，所以不能利用胚胎或卵细胞冷冻技术来保存生育能力。因此卵巢组织冷冻保存技术成为一种选择；然而，冻存卵巢组织不可能去除恶性肿瘤细胞，例如白血病细胞，冻存组织移植时会将肿瘤细胞重新注入患者体内。最近已有报道称已治愈的癌症患者在移植冻存卵巢组织后癌症复发。在对雄性老鼠的一些研究表明，重新注入10个AML细胞就能诱导发生白血病。因此，移植前应仔细检验复苏的卵巢组织。此外，携带BRAC1和BRAC2突变基因的乳腺癌患者有增加卵巢癌发生的潜在风险。为了避免移植卵巢组织导致重新植入癌细胞的风险，从组织中分离培养卵泡细胞是一种可行的方法。这些方法的目标是从卵泡囊中提取成熟的卵细胞体外受精，形成胚胎后移入母体子宫。
卵细胞提取技术开始于年，到现在提取技术已有很大的提高。从卵巢中提取的单个卵泡细胞可以在二维或三维系统中培养。例如，牛卵泡细胞在2D培养系统中分泌雌二醇并形成窦腔，这表明2D系统能够培养卵泡细胞并保存其功能。在最新的报告中，研究者通过培养小鼠卵泡细胞发现3D培养系统比2D能更好的维持细胞增殖空间、增长率和基因表达模式以维持卵母细胞的正常生长增殖。3D体外培养技术通过维持一种球形形态及维持卵细胞与体细胞的细胞与细胞间，细胞与间质间的相互作用来模拟机体内卵巢的生理环境。研究证明3D系统使卵泡细胞存活率更高，获得更成熟的卵泡细胞和卵母细胞，使其分泌更多的类固醇激素，研究证明3D系统可以用于培养小鼠、水牛、猕猴及人卵泡细胞。
2、卵泡细胞移植（人造卵巢）
体外培养卵泡细胞技术可以替代卵巢组织移植技术，从而避免重新获得癌细胞的风险，研究人员也一直在研究人造卵巢移植技术。人造卵巢技术是从患者的冻存卵巢组织中提取卵泡细胞与其他细胞，共同培养在3D培养体系中，使卵泡细胞生长在一个类似于卵巢组织的环境中，将卵泡细胞移植至患者体内，患者有恢复生殖和内分泌功能的可能。研究人员已经能够培育从小鼠体内提取的卵泡细胞。研究人员观察发现将卵细胞移植至小鼠后血管内有纤维蛋白凝块形成。最近的研究表明，一个使用海藻酸微囊剂和来自小鼠的粒层细胞与卵泡膜细胞的人造卵巢能够分泌性激素雌激素和孕激素，原始卵巢细胞接种到脱细胞支架并分泌雌二醇。这些研究反映出人造卵巢技术的进展，由于人造卵巢技术可以恢复内分泌系统的功能，所以人造卵巢技术不仅可以为癌症患者保存生育能力，也可以应用于激素替代治疗。
3、卵原细胞干细胞
无论是体外培养卵泡技术或是人造卵巢技术，当在癌症患者卵巢内无法提取健康的卵泡细胞时，可以考虑患者其他来源的遗传物质，包括卵原细胞干细胞(OSCs)。但是卵原细胞干细胞的存在仍然是有争议的。另一个潜在来源可能是卵母细胞来源于胚胎干细胞(ES)或诱导多能干细胞(iPS)。该方法已在雄性小鼠获得成功，获取的精子来源于胚胎干细胞。最新的研究指出研究人员已在小鼠体内成功的培养出卵母细胞的胚胎干细胞。这些研究为那些因为化疗和放射治疗治疗而失去生育能力的患者培养出卵母细胞这项技术提供了科学理论依据。这些技术也可能应用于卵巢早衰的治疗。
4、体外激活卵泡
从青春期前的癌症患者体内提取卵巢组织这其中包含不成熟的原始卵泡，必须激活卵泡，使其继续生长至成熟的卵母细胞受精。这项技术同样适用于由原发性卵巢癌导致卵巢功能下降导致的卵细胞储备减少的患者。研究人员已经成功运用卵巢分化，探针和激光技术诱导原始卵泡活化。其原理是破坏卵巢Hippo信号通路，促进体细胞和颗粒细胞内肌动蛋白的聚合，从而激活卵巢中的原始卵泡。这项研究证明原始卵泡是被周围细胞限制生长，Hippo信号调节原始卵泡的生长和物质交换。在自体移植前激活Hippo信号后,卵泡会被Akt激活，PI3K活化，PTEN抑制。这项技术有助于提高活产率。
5、针对靶向药物的应用
（1）利用纳米粒子
研究人员继续把重点放在寻求更好的方法来保护卵母细胞免受癌症治疗毒性的影响。一种方法是用纳米粒子封装专门针对癌细胞的化疗试剂，从而减少血浆水平的毒性及这些药物对非靶向器官的毒性，如对卵巢的影响。这种方法可以运用于其他化疗药物，在对肿瘤细胞更有针对性的同时保护性腺。
（2）使用保护剂
其他的研究旨在开发保护剂，在杀死肿瘤细胞的同时，也保护卵母细胞免受化疗和放射治疗的影响(图2b)。几项研究已经成功开发出一些保护剂，例如细胞凋亡抑制剂--伊马替尼，AS、T3、S1P、G-CSF和它莫西芬。研究证明甲磺酸伊马替尼(格列卫，瑞士巴塞尔诺华制药生产)与蛋白质酪氨酸激酶c-Abl结合保护卵母细胞。也有研究指出放射治疗和顺铂通过引起DNA损伤上调c-Abl从而激活细胞凋亡通路。TAp63是c-Abl下游信号分子，是调控原始卵母细胞死亡过程的主要因子，这表明在使用甲磺酸伊马替尼后，c-Abl参与抑制卵母细胞凋亡。尽管研究已证明DNA损伤上调c-Abl信号，但是还需要进一步的研究来明确c-Abl与卵母细胞死亡的相关性以及c-Abl和TAp63之间的调控关系。
研究证明AS与Cy联合使用可作为一种免疫调节剂调控卵母细胞转化为卵泡。通过抑制细胞凋亡和下调PI3K/PTEN/AKT信号通路，Cy和AS联合使用处理小鼠比Cy单独使用产出更多数量的小鼠幼崽。这一发现表明AS可以抑制由Cy引起的卵泡细胞异常激活和生长。同时临床试验表明AS对人体无副作用。然而，Cy激活原始卵泡细胞抑制细胞凋亡具体机制仍需进一步探索以明确。3、5、3三碘甲状腺氨酸(甲状腺激素，T3)有抗细胞凋亡作用，并抑制紫杉醇诱导的颗粒细胞凋亡。然而，保护剂对T3抵抗化疗药物的影响并未明确，仍需进一步的探究。鞘氨醇-1-磷酸(S1P)可以抑制鞘磷脂水解诱导的细胞凋亡。患者接受放射治疗或者化疗药物，包括达卡巴嗪(DIC或DTIC)时，S1P(FTY)预处理对机体有保护作用。S1P预处理后Cy和阿霉素(DXR)联合运用于人卵巢组织，结果证明S1P对机体具有保护效应。研究者在猕猴体内重复实验，在S1P与放射联合处理后实验动物成功产出活体幼崽。但是，针对药物导致的细胞毒性，S1P对人卵巢细胞的保护机制仍需体内实验证明。此外,S1P必须直接作用于卵巢细胞，这成为临床应用的难题。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)通过保护卵巢血管能够缓解由Cy，白消安和顺铂引起的原始卵泡减少。尽管研究结果显示对化疗患者有保护作用，但其保护血管的具体机制仍不清楚。另外，有研究证明它莫西芬能够缓解由Cy，7,12-二甲基苯和DXR导致的大鼠卵巢卵泡减少，并且保护卵母细胞免受放射治疗的影响。总之，这些研究表明一些保护剂在不久的将来可能会用于临床保护卵母细胞免受化疗或放射治疗的影响。
作者：KimSY,etal.
编译：郭晨佳
校审：王晨
原文：
Towardprecisionmedicineforpreservingfertilityincancerpatients:existingandemergingfertilitypreservationoptionsforwomen.
