论文题目：ProfilesofgonadotropinsandsteroidhormonelikesubstancesinthehemolymphofmudcrabScyllaparamamosainduringthereproductioncycle

期刊：MarineandFreshwaterBehaviourandPhysiology

影响因子：0.94

年份：

通讯作者：叶海辉

单位：厦门大学海洋与地球学院海洋系

摘要

为了阐明拟穴青蟹血淋巴中促性腺激素样物质的作用，采用酶联免疫吸附实验测定了血淋巴中促卵泡激素、促黄体激素和类固醇激素的浓度。激素浓度数据分析与性腺发育阶段相关。酶联免疫吸附实验表明，在雌蟹中，卵泡刺激素水平在卵巢发育的早期达到峰值，而雌二醇和黄体生成素水平在卵巢成熟的晚期达到峰值。雄蟹睾丸激素和卵泡刺激素在精子细胞期达到高峰，黄体生成素在精子期达到高峰。这些结果表明，无脊椎动物卵泡刺激素和黄体生成素的物质存在于拟穴青蟹的血淋巴中，它们可能参与性腺的发育。

关键词：卵泡刺激素；黄体生成素；雌二醇；睾酮；拟穴青蟹；酶联免疫吸附实验

引言

在脊椎动物中，腺垂体分泌的促性腺激素由卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)组成。FSH和LH通过与位于性腺细胞质膜的受体结合，刺激性腺的发育，在配子发生中起重要作用。哺乳动物卵泡刺激素和黄体生成素的功能已被广泛研究；然而，对于其他脊椎动物和无脊椎动物，特别是甲壳类动物，它们的功能仍然不清楚。据报道，哺乳动物卵泡刺激素和黄体生成素对沙虾的卵巢发育有刺激作用；卵泡刺激素刺激卵巢中许多体细胞的生长，而黄体生成素促进性细胞的减数分裂。最近，通过免疫细胞化学技术在拟穴青蟹和三疣梭子蟹中也检测到脊椎动物促卵泡激素和促黄体生成素样物质。然而，还没有关于甲壳动物生殖周期中卵泡刺激素和黄体生成素分布的报告。一些研究表明，孕酮和雌二醇样类固醇的波动水平与几种甲壳动物的卵黄发生周期密切相关，尽管类固醇激素在甲壳类动物中的确切作用仍然未知。拟穴青蟹是一种重要的商品蟹类，目前的研究主要集中在养殖、捕捞和资源增殖方面。内分泌学方面，包括雄激素腺的结构和功能，定位雌激素和雄激素的受体已有报道。本研究报告了无脊椎动物血淋巴中卵泡刺激素、黄体生成素和类固醇激素水平的动态变化，是了解甲壳动物神经内分泌功能的研究体系中重要的一部分。

材料与方法实验对象

拟穴青蟹体长.6-8.7厘米，购自中国厦门当地的商贩。螃蟹被保存在装有6-8摄氏度海水的水泥缸里，盐度为6ppt，连续曝气。他们被喂以活蛤蜊，并保持正常的昼夜周期(/小时)。每天更换一次50%海水。这些螃蟹在被处死前至少驯化了7天。血淋巴样品用离心管从培养皿中收集并在4摄氏度环境下保存。收集的样品在8.×g条件下离心0分钟，收集上清液并储存在-8摄氏度环境内，随后用酶联免疫吸附法进行分析。

实验试剂

卵泡刺激素酶联免疫试剂盒、黄体生成素酶联免疫试剂盒和睾酮酶联免疫试剂盒由诊断系统实验室(美国)生产。雌二醇酶联免疫试剂盒由开曼化学公司(美国)生产。

酶联免疫吸附测定

根据制造商建议的方案进行测定。该检测试剂盒基于与乙酰胆碱酯酶相连的复合激素和示踪剂之间的间接竞争。步骤如下:()制备洗涤缓冲液和抗体-酶偶联物溶液；(b)将00ml标准品、质控品和样品添加到适当的孔中；(c)在室温下孵育孔h；(d)清空孔并用洗涤缓冲液冲洗五次；(e)向每个孔中加入00ml抗体-酶结合物溶液；(f)在室温下孵育孔0min；(g)清空孔并用洗涤缓冲液冲洗五次；(h)向每个孔中加入00mlTMB溶液；(I)在室温下在黑暗中孵育孔0min；(j)增加00ml终止试剂到每孔中；(k)在nm波长下读取板，背景波长校正设置在60nm波长。

统计分析方法

生物数据和分析进行回归和单向方差分析(方差分析)使用微软Excel和SPSS0.0。当识别出组间差异时，使用图基检验进行均值间的多重比较。显著性水平为p＜0.05。

实验结果雌蟹雌二醇的变化

雌二醇达到最低浓度(8.48±7.0pgmL-)在发育早期，在未发育阶段浓度第二低。在发育阶段，雌二醇开始增加。激素浓度达到峰值(75.4±4.0pgmL-)处于接近成熟阶段。此后，激素浓度逐渐降低(图)。

图.雌性拟穴青蟹卵巢发育过程中雌二醇的变化。一:未发展阶段；二:早期发展阶段；三:发展阶段；四:接近成熟阶段；五：:成熟阶段；六:产卵后阶段。雌蟹卵泡刺激素和黄体生成素的变化

FSH浓度达到峰值(0.49±0.0mIUml-)在雌蟹的早期发育阶段。在发育阶段，激素浓度略有下降(0.8±0.4mIUmL-).之后激素浓度急剧下降。FSH降至0.05±0.0mIUmL-处于接近成熟的阶段。在成熟阶段和产卵后阶段，未检测到FSH(图)。黄体生成素浓度在生殖周期中保持在低水平。未发育阶段，黄体生成素浓度为0.06±0.00mIUmL-。激素浓度逐渐升高，达到峰值(0.08±0.mIUmL-)在接近成熟的阶段。成熟阶段，黄体生成素浓度略微减少，在成熟阶段后，我们的检测中未检测到黄体生成素（图）。

图.雌性拟穴青蟹卵巢发育过程中卵泡刺激素的变化。一:未发展阶段；二:早期发展阶段；三:发展阶段；四:接近成熟阶段；五：:成熟阶段；六:产卵后阶段。图.雌性拟穴青蟹卵巢发育过程中黄体生成素的变化。一:未发展阶段；二:早期发展阶段；三:发展阶段；四:接近成熟阶段；五：:成熟阶段；六:产卵后阶段。雄蟹睾酮的变化

精原细胞期雄蟹血淋巴睾酮浓度(±7pgmL-)高于精母细胞期(94±8pgmL-).激素浓度达到峰值(±7pgmL-)在精子细胞阶段。在精子期和静息期，激素浓度略有下降(图4)。

图4.雄性拟穴青蟹睾丸发育过程中睾酮的变化。一:精原细胞期；二:精母细胞期；三:精子细胞期；四:精子阶段；五:休止期。

雄蟹卵泡刺激素和黄体生成素的变化

卵泡刺激素浓度从精原细胞期上升到精母细胞期，达到峰值(0.±0.9mIUmL-)在精子细胞阶段。在精子阶段，不能检测到卵泡刺激素(图5)。

图5.雄性拟穴青蟹睾丸发育过程中卵泡刺激素的变化。一:精原细胞期；二:精母细胞期；三:精子细胞期；四:精子阶段；五:休止期。

在整个生殖周期中，黄体生成素浓度通常保持在较低水平。激素浓度达到峰值(0.4±0.0mIUmL-)在精子阶段(图6)。

图6.雄性拟穴青蟹睾丸发育过程中黄体生成素的变化。一:精原细胞期；二:精母细胞期；三:精子细胞期；四:精子阶段；五:休止期。

讨论雌蟹

雌二醇在其他甲壳类动物血淋巴中的分布已有报道。中国对虾血淋巴中的雌二醇水平在卵黄发生初期达到高峰，而在卵黄发生前期和卵巢成熟期则保持相对较低的水平。罗氏沼虾血淋巴中的雌二醇水平在卵巢成熟期间相对较高，在未发育阶段和产卵后阶段均达到最低。在卵黄发生期，克氏盘斑蝥血淋巴中的雌二醇水平逐渐升高，但没有降低直到排卵。锯缘青蟹血淋巴中的雌二醇浓度在卵黄形成前较低，在卵黄形成初期显著升高，在卵黄形成中期略有升高。在拟穴青蟹卵巢发育的早期(第二阶段)，卵原细胞活跃增殖，为卵黄发生做准备。进入卵巢发育阶段(三期)，卵母细胞生长迅速，初级卵黄发生旺盛。在接近成熟阶段(ⅳ期)，卵母细胞发育和二次卵黄发生接近结束。结果表明，雌二醇的上调与拟穴青蟹卵巢的发育密切相关，在卵黄发生过程中，雌二醇浓度持续升高，在卵黄囊期达到峰值，随后下降。这种观察到的模式与上述甲壳动物相似，表明雌二醇可能促进卵黄发生和卵巢发育。

在雌性脊椎动物中，卵泡刺激素促进卵泡的发育、生长和成熟。卵泡刺激素还能促进卵巢颗粒细胞分泌雌激素，并诱导卵母细胞对其他激素的敏感性。免疫细胞化学实验表明，在接近成熟阶段，拟穴青蟹脑中的FSH免疫反应强于发育早期。在我们的研究中，卵泡刺激素浓度在雌蟹发育早期的血淋巴中达到峰值，然后逐渐降低。甚至在成熟阶段都检测不到。难以理解的是，在卵黄发生期，拟穴青虫血淋巴中卵泡刺激素的变化趋势不是增加，而是减少。

黄体生成素与卵泡刺激素合作，促进卵泡的发育和成熟，加速颗粒细胞的增殖，参与子宫内膜细胞合成雌激素，诱导雌性脊椎动物排卵。拟穴青蟹血淋巴中的黄体生成素浓度在卵巢发育期间(四期)逐渐增加并达到峰值，然后在ⅴ期略有下降，在产卵后阶段(六期)几乎检测不到。简而言之，雌蟹体内的黄体生成素浓度在产卵前不断增加至峰值，然后在产卵后急剧下降。这种变化模式与其加速排卵的功能一致。

雄蟹

在雄性脊椎动物中，睾酮的主要生理功能是(a)刺激生殖器官成熟，维持其功能；(b)促进第二性征并保持其正常状态；(c)通过反馈调节促进精子发生和成熟，维持雄激素分泌的稳定性。

拟穴青蟹血淋巴中睾酮浓度的变化趋势与雄性中华绒螯蟹相似。雄蟹血淋巴中睾酮浓度在精原细胞期高于精母细胞期，提示睾酮可能与代谢率和促进生长有关。在睾丸快速发育的精母细胞期，血淋巴中睾酮浓度升高。睾丸发育成熟时，睾丸激素浓度达到高峰，说明雄激素成熟过程需要睾丸激素的参与。

当雄蟹成熟到精子阶段，睾酮浓度急剧下降。精子化后，睾丸开始退化。静止期血淋巴中睾酮浓度略高于精子期血淋巴中睾酮浓度，差异不显著(p＜0.05)。拟穴青蟹血淋巴中睾酮浓度的变化趋势与睾丸的发育一致，说明睾酮可能促进了拟穴青蟹睾丸的成熟。

在雄性甲壳动物中，神经激素如性腺抑制激素和性腺刺激激素通过雄激素腺间接影响睾丸。拟穴青蟹的雄腺在精子形成期之前一直处于增殖状态，在精子形成期之后才停止发育。在雄性脊椎动物中，卵泡刺激素和黄体生成素调节精子发生。目前的研究表明，卵泡刺激素水平在精母细胞阶段最高。这与卵泡刺激素刺激雄激素腺体生长和发育的功能有关。进入精子期，雄激素腺增殖缓慢，对卵泡刺激素的需求下降，因此拟穴青蟹血淋巴中卵泡刺激素浓度较低。

黄体生成素浓度在睾丸发育过程中逐渐增加，在精子期达到高峰。这种变化趋势与雄激素腺的发育相一致。我们推测拟穴青蟹卵泡刺激素和黄体生成素共同调节雄激素腺的功能；精前期以卵泡刺激素为主，精后期以黄体生成素为主。进一步测定神经器官中的卵泡刺激素和黄体生成素以及性腺中的类固醇，可能有助于进一步揭示拟穴青蟹的生殖内分泌机制。

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