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本篇文章由默克公司供稿

新生命的诞生是每个幸福家庭快乐的源泉之一，一个健康宝宝的呱呱坠地是每一对父母的心愿。然而并不是所有家庭和夫妻都能够如愿以偿，世界卫生组织预测不孕不育症将被列入21世纪人类三大疾病之一，仅次于肿瘤和心血管疾病。近年来，由于自然环境恶化、工作压力增加、女性生育年龄推迟等因素影响，不孕不育症的发病率逐年增高。自年世界第一例试管婴儿诞生以来，辅助生殖技术在全球范围内迅速发展，已成为治疗不孕症的非常重要的手段。从年中国大陆第一例试管婴儿诞生，经过30多年的发展，国内辅助生殖技术已经达到国际领先水平。促性腺激素是调节脊椎动物性腺发育，促进性激素生成和分泌的糖蛋白激素，促性腺激素药物包括天然和重组产品，天然产品包括从绝经妇女尿中提取的促性腺激素,如人绝经后促性腺激(hMG)、尿源性人卵泡刺激素(uFSH);从孕妇尿中提取的人绒毛膜促性腺激素(uhCG)。基因重组产品包括重组FSH(rFSH)、重组促黄体生成素(rLH)和重组hCG(rhCG)。促性腺激素药物刺激卵巢是不孕症治疗和辅助生殖技术的重要组成部分之一，为了获得更有效、安全并且满足大规模临床使用需求的促性腺激素产品，研究人员做了大量的探索和科研工作。俗话说，以史为鉴，可以知兴替，对药物发展历史的回顾同样能详细展示这个充满艰辛的历程，更利于掌握现在，展望未来。

促进卵子成熟——人绒毛膜促性腺激素(hCG)的发现

年，德国科学家Ascheim和Zondek证实妊娠妇女的血液和尿液中存在一种促性腺物质，该物质皮下注射给卵泡未成熟小鼠后能诱导卵泡成熟和黄素化。年推出第一个由人胎盘提取的商业化的促性腺激素hCG(见图1)，但研究者发现，在不使用促卵泡刺激素(FSH)而单独使用hCG时不能刺激卵泡发育。年，美国科学家Mazer和Ravetz在女性试验者中引入了两步治疗方案，即先用动物促性腺激素刺激卵巢，随后通过注射hCG使卵子最终成熟。hCG的发现让人们意识到，卵子的发育是可以借助外力来进行改变的，这为不孕不育的治疗奠定了基础。然而由于人类-动物免疫识别问题，卵巢对动物源性促性腺激素的反应在女性身体中仅能维持有限的一段时间。

图1hCG分子结构示意图，hCG分子具有两条相连的多肽链（α链和β链），α链含有2个糖基化位点，β链含有1个糖基化位点，存在一个氧-糖基化的长羧基末端片段（O-CHO）。

孕马血清促性腺激素(PMSG)的发现与音乐天才的诞生

年，美国科学家Cole和Hart首先向世人介绍了从怀孕的马的血清中提取促性腺激素（PMSG）。马在妊娠37~42天时，其子宫内膜表面分泌一种凝胶物质，孕50~70天时达到高峰，直至孕4个月时才消失，这种物质能释放入血，因此能够在马妊娠65天左右时从血中提取。年一位专业的钢琴家想要第二个孩子，但一直未能怀孕，牛津的一名医生为其注射了PMSG，医生开玩笑说：“这个孩子将成为赛马冠军！”。实际上，仅PMSG血清并不能成功妊娠，还需要其他药物的支持，为了维持妊娠，医生还使用了新的“雌激素”，即己烯雌酚（DES）。年1月，举世闻名的杰出大提琴演奏家JacquelineduPré出生，但她青春期中期反复出现抑郁倾向，甲状腺代谢不平衡，十几岁后出现麻木症状，成年后步态笨拙，25岁以后长期休息，这颗闪亮的巨星最终在她42岁时走向了生命的尽头。不过，JacquelineduPré的这些病症及她的英年早逝与其借助于辅助生殖技术的出生及应用PMSG是否有关并不十分明确。

PMSG和动物垂体促性腺激素的发现和使用，无疑是促性腺历史上的重要里程碑，开启了应用促性腺激素治疗不孕不育的先河。从动物垂体提取的促性腺激素制剂在欧洲和美国应用到二十世纪六十年代初，直到“抗激素”的天然免疫现象被充分认识，它的使用才逐渐下降。所谓的“抗激素”现象即在使用动物源性制剂后，会在人体内形成抗体，抗体不仅能中和药物本身，还有可能中和内源性促性腺激素，最终使得卵巢对药物失去反应。这一度使得研究进展陷入僵局，既然动物源性制剂和人体会形成抗体，那么，使用人源制剂是不是就可以避免这个问题呢？于是科研人员开始致力于从人源原料中提取促性腺激素。

人垂体促性腺激素，带来可怕的怪病？

年，Gemzell从人类尸体的垂体（促性腺激素是由垂体合成和分泌的）中提取了尸源性促卵泡激素(hPG)，并报告使用这种制剂可使卵泡发育，随后将其与hCG一起用于女性以刺激排卵。年，Bettendorf等人成功地在垂体切除患者的身上使用垂体促性腺激素进行卵巢刺激。随后，人垂体来源的hPG开始广泛应用于临床。但是，在和年，分别在澳大利亚、法国和英国都发现一种怪病，即克雅氏病。受感染的人会发生睡眠紊乱、个性改变、共济失调、失语症、视觉丧失、肌肉萎缩、肌阵挛、进行性痴呆等症状，并且会在发病的一年内死亡，该病被高度怀疑与患者使用了人垂体来源的促性腺激素或生长激素有关。虽然没有一例病例与制药公司生产并注册的人垂体来源hPG有关，但是，在民众的不信任和恐慌中，hPG还是退出了市场，这些人类垂体药物在20世纪80年代停产。那么促性腺激素的发展是否就停滞不前了呢？答案当然是否定的，科研工作者从来就不那么轻言放弃！很快，促性腺激素的研究又迎来了新的进展！

绝经妇女尿液提取物，人绝经后促性腺激素(hMG)的由来

当“促性腺激素(Gn)之父”BrunoLunenfeld(见图2)还在读博的时候，他的一项课题是关于雌激素和雄激素对萎缩性阴道上皮的影响，当时试验召募了名绝经妇女，治疗前，收集她们24小时的尿液，测量激素水平，将尿液提取物注入幼年小鼠体内，结果他惊奇的发现，在雌激素诱导下小鼠的阴道上皮发生了改变，BrunoLunenfeld观察到小鼠的子宫重量增加，并且其卵巢发生了多卵泡的发育！由此他认为绝经妇女会分泌一种刺激小鼠卵巢发育的物质，并将其命名为hMG。这一发现成为生殖医学史上的不可忽视的重大发现之一，BrunoLunenfeld教授因此被冠以“促性腺激素之父”的美誉。

图2：Gn之父BrunoLunenfeld

年，BrunoLunenfeld与雪兰诺公司在绝经后妇女尿液中首次成功提取hMG，并生产了全球第1支人尿促性腺激素hMG制剂，hMG被批准用于无排卵妇女的单卵泡的发育和接受控制性卵巢刺激的妇女的多卵泡发育。自此之后，尿源促性腺激素仿佛又迎来了曙光，开始应用在不孕不育妇女的治疗中，但这时就停下脚步似乎还为时过早，因为当时生产的hMG纯度仅有5%，即FSH和促黄体生成素LH（hMG中的两个主要活性成分）的含量仅占5%，其余95%全都是杂质，且hMG制剂中还同时含有hCG。如此低的纯度，大量的杂质，是不是还会引起克雅氏病？大量的问题仍萦绕在科学家们的心头，他们意识到，要想为患者带来更大的获益，必须制备更纯的药物！

制备更纯的药物，尿源性促卵泡激素(uFSH)的出现

随着不孕不育技术的发展，临床需求也在发生变化，医生们开始意识到不同患者可能需要使用不同的治疗方案以及不同的FSH和LH剂量。因此科研人员开始尝试着使用各种方法把FSH与LH分离开。为了得到更纯的药物，Eshkol等开始使用一种含有多克隆LH抗体的亲和柱来提纯hMG制剂。制备药物时将hMG通过这个柱子，其中的LH与固定化的LH抗体结合后被吸附到柱子上，而FSH和其他蛋白质则顺利通过柱子7。这样就得到了含有很少LH的相对纯的FSH，就这样，在年uFSH出现了。

但是，尿源产品在原料来源与生产过程中仍存在无法避免的缺陷，在原料来源上缺乏对尿源收集和捐赠者的规范，无法进行原料溯源，在生产中提取和纯化过程可能会使蛋白质变性、交叉污染等也无法完全避免。从尿液中提取促性腺激素之初，仅有少量的妇女提供尿液(见图3)，可以进行良好的质量控制，如果妇女患病或服用药物，就不会收集她的尿液。在年至年间，随着对不孕不育认识的提高，以及不孕不育治疗技术的发展，对促性腺激素制剂的需求逐渐增加。在全球范围内，新的临床适应症和不孕不育治疗的发展导致对促性腺激素的需求呈指数增长，到年初，所需的尿液捐赠者数量已超过10万。而到了年每年需要1.2亿升尿液才能满足世界范围的临床需要，而这就需要60万个供尿者(见图4)！如此庞大的需求量，很难做到对每个供尿女性都进行单独评价，供体来源和尿液收集不再能被追踪、控制或规范，从而导致人们对安全性的重大担忧。考虑到这些潜在风险，许多国家制定了相关法规，年，澳大利亚药物评价委员会决定用具备高纯度和高度安全性的重组促性腺激素制剂代替尿源性产品。同年，法国出版了警告尿源性产品的安全性册子。年，英国将高纯尿FSH退出了市场。

图3：年修女尿液收集示意图

图4：年后捐赠者数量及尿液需求量示意图

革故鼎新，传奇经典药物重组促卵泡激素α(rFSH-α)问世

自上世纪五十年代，分子生物学神秘的大门被不拘一格的DNA之父JamesDeweyWatson一脚踢开，科学大佬们便长驱直入，势不可挡，当时通过DNA重组技术大规模生产生物蛋白已经发展到可以很快制造出一些用于医学治疗的生物制品，如胰岛素等。随着对这些新技术的进步和对不孕不育治疗的更深入理解，科研人员开始了重组促卵泡激素的研发之路探索。

要得到重组促性腺激素首先得确定和分离出特定的蛋白质分子。美国科学家Rathnam和Saxena分别于年和年确定了FSH的α和β亚单位的结构(见图5)，这对重组FSH的研发起到了关键性的推动作用！随后编码FSH分子的基因被成功克隆，这也对后期量产起到了关键作用，在适当的条件下，将这些基因通过质粒插入到宿主细胞的核DNA中，之后，在中华仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）中就能表达FSH。听上去好像很简单，但实际上生产重组促性腺激素是很难的，因为FSH的分子结构十分复杂，并且还需要翻译后的修饰过程，包括蛋白折叠和糖基化。在经过反复的实验后，科学家们发现在哺乳动物细胞内，复杂糖蛋白能很好地进行折叠组装和翻译后修饰，在分子结构、理化性质和生物学功能等方面与天然蛋白更接近，因此选择了CHO细胞作为表达载体来制备rFSH。。

图5：FSH分子示意图，FSH分子具有两条相连的多肽链（α链和β链），每条链含有2个糖基化位点，α链含有92个氨基酸，β链含有个氨基酸。

年，雪兰诺实验室生产出世界上第一个用于临床的基因重组FSH，至此促性腺激素经典药物rFSH-α正式问世。基因重组产品可以规避尿蛋白和其他致命病毒污染，采用自然选择的方式筛选高效率转染成功细胞，保证以安全可靠的生产方式大规模生产(见图6)。年，rFSH-α在欧盟获得批准上市，就此打开了促性腺激素的全新篇章。年时，BrunoLunenfeld提出，随着重组产品的问世，hMG和uFSH在多年使用后，将停留在历史的长河中。

图6：rFSH生产制备过程示意图，主要流程为：第一步基因重组，把含有FSH编码的基因附在载体DNA上；第二步基因转染和筛选，重组的基因被转染到CHO细胞内，基因转染成功后可以恢复合成核酸，转染不成功失去核酸的合成就会自然死亡；第三步细胞培养和扩增，在培养基中对筛选的细胞进行培养并在生物反应器中进行扩增后收集；第四步纯化，使用抗原抗体相结合的纯化方式，特异度高，洗脱条件温和，全部过程不会损害FSH活性。

但这个时候的rFSH-α还在应用生物标称，即依据鼠卵巢细胞对FSH的反应装载药物，这就相当于是间接测定(见图7)，大鼠反应的个体差异会导致药物批次间差异较大，选用动物的质量和数量，以及技术人员的操作技能等均会对药物产生较大影响。为此在90年代，欧洲欧盟药品审评局(EMEA)和美国食品药品监督管理局(FDA)均建议雪兰诺公司发展“质量标称”的生产工艺，要求用更精确的理化分析方法替代生物标称，即依据FSH蛋白的数量装载药物(见图8)，相当于直接测定有效蛋白含量，更加精准。但是，并不是所有的促性腺激素都可以使用质量标称，只有当包括高级结构在内的药物物理化学信息可以完全通过理化方法确定，且该方法被证明了与生物活性有关联，同时药物还要存有完整的历史生产档案，满足这些条件，才能应用质量标称。由于rFSH-α使用基因重组技术，通过肽图分析可以确定一级结构，通过纯度分析证明了其纯度高、无杂质、亚基分布变异小和低氧化降解产物，通过糖谱分析得到唾液酸化水平具有一致性，对糖蛋白异质体的程度和概况得以鉴定明确;有完整的生产历史档案，有多年生产的历史数据，足以证明其批次间比活性的一致性，意味着rFSH-α的蛋白含量和生物效价是长期稳定不变的，rFSH-α分子始终保持完整性，这才使得质量标称成为可能。年，经过努力和创新，rFSH-α开创了基因重组技术与质量标称相结合的FSH新纪元。rFSH-α质量标称采用分子筛-高效液相色谱法，准确测定FSH含量，得到含量更为精准可控的药物，一次刺激给予患者的药物剂量稳定，为患者带来更稳定的获卵数和临床妊娠率。截至目前，全球有将近万婴儿在rFSH-α的帮助下诞生，rFSH-α为众多不孕不育的家庭带来了新生的希望！其安全性也历经了25年的临床验证。

图7：生物标称示意图，选择出生21-22d，体重45-55g雌性大鼠，FSH皮下注射，每日1次，连续3d，同时伴随持续的hCG刺激大鼠，使FSH剂量与卵巢增重的量效反应线性关系更加敏感，第4d处死大鼠，解剖摘取卵巢称重。

图8：质量标称示意图，采用高效液相色谱分析法，直接测定有效蛋白含量，依据有效蛋白的含量装载药物。

总结：百年发展，精进不休

纵观促性腺激素百年的漫长发展历程，可以看到一个经典产品的产生，需要不断艰辛的创新与发展，但坚持不懈必定迎来胜利的曙光。未来，我们也将见证更多创新药物的出现为万千患者带来获益！

参考文献

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往期回顾

百岁肝素：不老的传奇（上篇）

百岁肝素：不老的传奇（中篇）

百岁肝素：不老的传奇（下篇）

千年传承，中华瑰宝——牛年话牛黄

年是中国生化制药工业协会成立30周年，协会正在筹备编撰一本关于生化药物的科普性图书，本篇文章为图书内容参考模板。具体通知如下，望大家踊跃参与！